CRISPR-Cas9基因编辑技术简介
2024-05-13
1. CRISPR-Cas9基因编辑技术简介
CRISPR-Cas9是继ZFN、TALENs等基因编辑技术推出后的第三代基因编辑技术，短短几年内,CRISPR-Cas9技术风靡全球, 成为现有基因编辑和基因修饰里面效率最高、最简便、成本最低、最容易上手的技术之一，成为当今最主流的基因编辑系统。
一、什么是CRISPR-Cas系统
CRISPR-Cas系统是原核生物的一种天然免疫系统 。某些细菌在遭到病毒入侵后，能够把病毒基因的一小段存储到自身的 DNA 里一个称为 CRISPR 的存储空间。当再次遇到病毒入侵时，细菌能够根据存写的片段识别病毒，将病毒的DNA切断而使之失效。
C RISPR-Cas系统包含CRISPR基因座和Cas基因（CRISPR关联基因）两部分。
1、CRISPR（/'krɪspər/）是原核生物基因组内的一段重复序列 。CRISPR全称Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats（成簇的规律性间隔的短回文重复序列）。分布在40%的已测序细菌和90%的已测序古细菌当中。 （注：生活在深海的火山口、陆地的热泉以及盐碱湖等极端环境中，有一些独特结构的细菌，称为古细菌）
CRISPR基因序列主要由前导序列（leader）、重复序列（repeat）和间隔序列（spacer）构成 。
①前导序列 ：富含AT碱基，位于CRISPR基因上游， 被认为是CRISPR序列的启动子 。
②重复序列 ：长度约20–50 bp碱基且包含5–7 bp回文序列，转录产物可以形成发卡结构， 稳定RNA的整体二级结构 。
③间隔序列 ： 是被细菌俘获的外源DNA序列 。这就相当于细菌免疫系统的“黑名单”，当这些外源遗传物质再次入侵时，CRISPR/Cas系统就会予以精确打击。
2、Cas基因位于CRISPR基因附近或分散于基因组其他地方，该基因编码的蛋白均可与CRISPR序列区域共同发生作用。因此，该基因被命名为CRISPR关联基因（ CRISPR associated，Cas ）。
Cas基因编码的Cas蛋白在防御过程中至关重要，目前已经发现了Cas1-Cas10等多种类型的Cas基因。
依据Cas蛋白在细菌免疫防御过程中参与的角色，目前将CRISPR-Cas系统分为两大类。
第一大类 ：它们切割外源核酸的效应因子为多个Cas蛋白形成的复合物，包括Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅳ型。
第二大类 ：它们的作用因子是比较单一的Cas蛋白，比如Ⅱ型的Cas9蛋白和Ⅴ型的Cpf蛋白。
目前，被最为广泛应用的CRISPR系统是II型CRISPR-Cas系统，也就是CRISPR-Cas9系统。
二、CRISPR-Cas9的作用原理
对于CRISPR-Cas9的作用机理可以分为三个阶段来理解。
1、第一阶段：CRISPR 的高度可变的间隔区的获得 （ 俘获外源DNA，登记“黑名单” ）
CRISPR 的高度可变的间隔区获得，其实就是指外来入侵的噬菌体或是质粒DNA 的一小段DNA 序列被整合到宿主菌的基因组，整合的位置位于CRRSPR 的5' 端的两个重复序列之间。因此，CRISPR 基因座中的间隔序列从5' 到3' 的排列也记录了外源遗传物质入侵的时间顺序。
新间隔序列的获得可能分为三步：
第1步：Cas1和Cas2编码的蛋白将扫描入侵的DNA，并识别出PAM区域，然后将临近PAM的DNA序列作为候选的原型间隔序列。
第2步：Cas1/2蛋白复合物将原间隔序列从外源DNA中剪切下来，并在其他酶的协助下将原间隔序列插入临近CRISPR序列前导区的下游。
第3步：DNA会进行修复，将打开的双链缺口闭合。这样一来，一段新的间隔序列就被添加到了基因组的CRISPR序列之中。
2、第二阶段：CRIPSR 基因座的表达（包括转录和转录后的成熟加工）
CRISPR序列在前导区的调控下转录产生pre-crRNA（ crRNA的前体 ），同时与pre-crRNA序列互补的tracrRNA（ 反式激活crRNA ）也被转录出来。pre-crRNA通过碱基互补配对与tracrRNA形成双链RNA并与Cas9编码的蛋白组装成一个复合体。它将根据入侵者的类型，选取对应的“身份证号码”（ 间隔序列RNA ），并在核糖核酸酶Ⅲ（ RNaseⅢ ）的协助下对这段“身份证”进行剪切，最终形成一段短小的crRNA（ 包含单一种类的间隔序列RNA以及部分重复序列区 ）。
crRNA，Cas9以及tracrRNA组成最终的复合物，为下一步剪切做好准备。
3、第三阶段：CRISPR/Cas 系统活性的发挥（靶向干扰）
crRNA，Cas9以及tracrRNA组成最终的复合物就像是一枚制导导弹，可以对入侵者的DNA进行精确的打击。这个复合物将扫描整个外源DNA序列，并识别出与crRNA互补的原间隔序列。这时，复合物将定位到PAM/原间隔序列的区域，DNA双链将被解开，形成R-Loop。crRNA将与互补链杂交，而另一条链则保持游离状态。
随后，Cas9蛋白精确的平端切割位点位于PAM上游3个核苷酸位置，形成平末端产物。Cas9蛋白的HNH结构域负责切割与crRNA互补配对的那一条DNA链，而RuvC结构域负责切割另外一条非互补DNA链。最终在Cas9的作用下DNA双链断裂（DSB），外源DNA的表达被沉默，入侵者被一举歼灭。
三、 CRISPR-Cas9基因编辑技术及应用…
tracrRNA-crRNA在被融合为单链向导RNA（sgRNA）时也可以发挥指导Cas9的作用。
CRISPR-Cas9基因编辑技术就是通过人工设计的 sgRNA（guide RNA）来识别目的基因组序列，并引导 Cas9 蛋白酶进行有效切割 DNA 双链，形成双链断裂，损伤后修复会造成基因敲除或敲入等，最终达到对基因组DNA 进行修饰的目的。
CRISPR-Cas9的广泛应用
1、基因敲除（Knock-out）
Cas9可以对靶基因组进行剪切，形成DNA的双链断裂。在通常情况下，细胞会采用高效的 非同源末端连接 方式（NHEJ）对断裂的DNA进行修复。但是，在修复过程中通常会发生碱基插入或缺失的错配现象，造成移码突变，（ 移码突变 ：是指DNA分子由于某位点碱基的缺失或插入，引起阅读框架变化，造成下游的一系列密码改变，使原来编码某种肽链的基因变成编码另一种完全不同的肽链序列。）使靶标基因失去功能，从而实现基因敲除。为了提高CRISPR系统的特异性，可将Cas9的一个结构域进行突变，形成只能对DNA单链进行切割造成DNA缺口的Cas9 nickase核酸酶。因此想要形成双链断裂的效果可以设计两条sgRNA序列，分别靶向DNA互补的两条链，这样两条sgRNA特异性的结合靶标序列，即可形成DNA断裂，并在修复过程中通过移码突变实现基因敲除
2、基因敲入（Knock-in）
当DNA双链断裂后，如果有DNA修复模板进入到细胞中，基因组断裂部分会依据修复模板进行 同源重组修复 （HDR），从而实现基因敲入。修复模板由需要导入的目标基因和靶序列上下游的同源性序列（同源臂）组成，同源臂的长度和位置由编辑序列的大小决定。DNA修复模板可以是线性/双链脱氧核苷酸链，也可以是双链DNA质粒。HDR修复模式在细胞中发生率较低，通常小于10%。为了增加基因敲入的成功率，目前有很多科学家致力于提高HDR效率，将编辑的细胞同步至HDR最活跃的细胞分裂时期，促进修复方式以HDR进行；或者利用化学方法抑制基因进行NHEJ，提高HDR的效率
3、基因抑制、基因激活（Repression or Activation）
Cas9的特点是能够自主结合和切割目的基因，通过点突变的方式使Cas9的两个结构域RuvC-和HNH-失去活性，形成的dCas9只能在sgRNA的介导下结合靶基因，而不具备剪切DNA的功能。因此，将dCas9结合到基因的转录起始位点，可以阻断转录的开始，从而抑制基因表达；将dCas9结合到基因的启动子区域也可以结合转录抑制/活化物，使下游靶基因转录受到抑制或激活。因此dCas9与Cas9、Cas9 nickase的不同之处在于，dCas9造成的激活或者抑制是可逆的，并不会对基因组DNA造成永久性的改变。
4、多重编辑（Multiplex Editing）
将多个sgRNA质粒转入到细胞中，可同时对多个基因进行编辑，具有基因组功能筛选作用。多重编辑的应用包括：使用双Cas9nickases提高基因敲除的准确率、大范围的基因组缺失及同时编辑不同的基因。通常情况下，一个质粒上可以构建2～7个不同的sgRNA进行多重CRISPR基因编辑。
5、功能基因组筛选
利用CRISPR-Cas9进行基因编辑可以产生大量的基因突变细胞，因此利用这些突变细胞可以确认表型的变化是否是由基因或者遗传因素导致的。基因组筛选的传统方法是shRNA技术，但是shRNA有其局限性：具有很高的脱靶效应以及无法抑制全部基因而形成假阴性的结果。CRISRP-Cas9系统的基因组筛选功能具有高特异性和不可逆性的优势，在基因组筛选中得到了广泛的应用。目前CRISPR的基因组筛选功能应用于筛选对表型有调节作用的相关基因，如对化疗药物或者毒素产生抑制的基因、影响肿瘤迁移的基因以及构建病毒筛选文库对潜在基因进行大范围筛选等。
2. CRISPR-Cas9基因编辑技术简介
CRISPR-Cas9是继ZFN、TALENs等基因编辑技术推出后的第三代基因编辑技术，短短几年内,CRISPR-Cas9技术风靡全球, 成为现有基因编辑和基因修饰里面效率最高、最简便、成本最低、最容易上手的技术之一，成为当今最主流的基因编辑系统。
一、什么是CRISPR-Cas系统
CRISPR-Cas系统是原核生物的一种天然免疫系统 。某些细菌在遭到病毒入侵后，能够把病毒基因的一小段存储到自身的 DNA 里一个称为 CRISPR 的存储空间。当再次遇到病毒入侵时，细菌能够根据存写的片段识别病毒，将病毒的DNA切断而使之失效。
C RISPR-Cas系统包含CRISPR基因座和Cas基因（CRISPR关联基因）两部分。
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1、CRISPR（/'krɪspər/）是原核生物基因组内的一段重复序列 。CRISPR全称Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats（成簇的规律性间隔的短回文重复序列）。分布在40%的已测序细菌和90%的已测序古细菌当中。 （注：生活在深海的火山口、陆地的热泉以及盐碱湖等极端环境中，有一些独特结构的细菌，称为古细菌）
CRISPR基因序列主要由前导序列（leader）、重复序列（repeat）和间隔序列（spacer）构成 。
①前导序列 ：富含AT碱基，位于CRISPR基因上游， 被认为是CRISPR序列的启动子 。
②重复序列 ：长度约20–50 bp碱基且包含5–7 bp回文序列，转录产物可以形成发卡结构， 稳定RNA的整体二级结构 。
③间隔序列 ： 是被细菌俘获的外源DNA序列 。这就相当于细菌免疫系统的“黑名单”，当这些外源遗传物质再次入侵时，CRISPR/Cas系统就会予以精确打击。
2、Cas基因位于CRISPR基因附近或分散于基因组其他地方，该基因编码的蛋白均可与CRISPR序列区域共同发生作用。因此，该基因被命名为CRISPR关联基因（ CRISPR associated，Cas ）。
Cas基因编码的Cas蛋白在防御过程中至关重要，目前已经发现了Cas1-Cas10等多种类型的Cas基因。
依据Cas蛋白在细菌免疫防御过程中参与的角色，目前将CRISPR-Cas系统分为两大类。
第一大类 ：它们切割外源核酸的效应因子为多个Cas蛋白形成的复合物，包括Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅳ型。
第二大类 ：它们的作用因子是比较单一的Cas蛋白，比如Ⅱ型的Cas9蛋白和Ⅴ型的Cpf蛋白。
目前，被最为广泛应用的CRISPR系统是II型CRISPR-Cas系统，也就是CRISPR-Cas9系统。
二、CRISPR-Cas9的作用原理
对于CRISPR-Cas9的作用机理可以分为三个阶段来理解。
1、第一阶段：CRISPR 的高度可变的间隔区的获得 （ 俘获外源DNA，登记“黑名单” ）
CRISPR 的高度可变的间隔区获得，其实就是指外来入侵的噬菌体或是质粒DNA 的一小段DNA 序列被整合到宿主菌的基因组，整合的位置位于CRRSPR 的5' 端的两个重复序列之间。因此，CRISPR 基因座中的间隔序列从5' 到3' 的排列也记录了外源遗传物质入侵的时间顺序。
新间隔序列的获得可能分为三步：
第1步：Cas1和Cas2编码的蛋白将扫描入侵的DNA，并识别出PAM区域，然后将临近PAM的DNA序列作为候选的原型间隔序列。
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第2步：Cas1/2蛋白复合物将原间隔序列从外源DNA中剪切下来，并在其他酶的协助下将原间隔序列插入临近CRISPR序列前导区的下游。
第3步：DNA会进行修复，将打开的双链缺口闭合。这样一来，一段新的间隔序列就被添加到了基因组的CRISPR序列之中。
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2、第二阶段：CRIPSR 基因座的表达（包括转录和转录后的成熟加工）
CRISPR序列在前导区的调控下转录产生pre-crRNA（ crRNA的前体 ），同时与pre-crRNA序列互补的tracrRNA（ 反式激活crRNA ）也被转录出来。pre-crRNA通过碱基互补配对与tracrRNA形成双链RNA并与Cas9编码的蛋白组装成一个复合体。它将根据入侵者的类型，选取对应的“身份证号码”（ 间隔序列RNA ），并在核糖核酸酶Ⅲ（ RNaseⅢ ）的协助下对这段“身份证”进行剪切，最终形成一段短小的crRNA（ 包含单一种类的间隔序列RNA以及部分重复序列区 ）。
crRNA，Cas9以及tracrRNA组成最终的复合物，为下一步剪切做好准备。
3、第三阶段：CRISPR/Cas 系统活性的发挥（靶向干扰）
crRNA，Cas9以及tracrRNA组成最终的复合物就像是一枚制导导弹，可以对入侵者的DNA进行精确的打击。这个复合物将扫描整个外源DNA序列，并识别出与crRNA互补的原间隔序列。这时，复合物将定位到PAM/原间隔序列的区域，DNA双链将被解开，形成R-Loop。crRNA将与互补链杂交，而另一条链则保持游离状态。
随后，Cas9蛋白精确的平端切割位点位于PAM上游3个核苷酸位置，形成平末端产物。Cas9蛋白的HNH结构域负责切割与crRNA互补配对的那一条DNA链，而RuvC结构域负责切割另外一条非互补DNA链。最终在Cas9的作用下DNA双链断裂（DSB），外源DNA的表达被沉默，入侵者被一举歼灭。
三、 CRISPR-Cas9基因编辑技术及应用…
tracrRNA-crRNA在被融合为单链向导RNA（sgRNA）时也可以发挥指导Cas9的作用。
CRISPR-Cas9基因编辑技术就是通过人工设计的 sgRNA（guide RNA）来识别目的基因组序列，并引导 Cas9 蛋白酶进行有效切割 DNA 双链，形成双链断裂，损伤后修复会造成基因敲除或敲入等，最终达到对基因组DNA 进行修饰的目的。
CRISPR-Cas9的广泛应用
1、基因敲除（Knock-out）
Cas9可以对靶基因组进行剪切，形成DNA的双链断裂。在通常情况下，细胞会采用高效的 非同源末端连接 方式（NHEJ）对断裂的DNA进行修复。但是，在修复过程中通常会发生碱基插入或缺失的错配现象，造成移码突变，（ 移码突变 ：是指DNA分子由于某位点碱基的缺失或插入，引起阅读框架变化，造成下游的一系列密码改变，使原来编码某种肽链的基因变成编码另一种完全不同的肽链序列。）使靶标基因失去功能，从而实现基因敲除。为了提高CRISPR系统的特异性，可将Cas9的一个结构域进行突变，形成只能对DNA单链进行切割造成DNA缺口的Cas9 nickase核酸酶。因此想要形成双链断裂的效果可以设计两条sgRNA序列，分别靶向DNA互补的两条链，这样两条sgRNA特异性的结合靶标序列，即可形成DNA断裂，并在修复过程中通过移码突变实现基因敲除
2、基因敲入（Knock-in）
当DNA双链断裂后，如果有DNA修复模板进入到细胞中，基因组断裂部分会依据修复模板进行 同源重组修复 （HDR），从而实现基因敲入。修复模板由需要导入的目标基因和靶序列上下游的同源性序列（同源臂）组成，同源臂的长度和位置由编辑序列的大小决定。DNA修复模板可以是线性/双链脱氧核苷酸链，也可以是双链DNA质粒。HDR修复模式在细胞中发生率较低，通常小于10%。为了增加基因敲入的成功率，目前有很多科学家致力于提高HDR效率，将编辑的细胞同步至HDR最活跃的细胞分裂时期，促进修复方式以HDR进行；或者利用化学方法抑制基因进行NHEJ，提高HDR的效率
3、基因抑制、基因激活（Repression or Activation）
Cas9的特点是能够自主结合和切割目的基因，通过点突变的方式使Cas9的两个结构域RuvC-和HNH-失去活性，形成的dCas9只能在sgRNA的介导下结合靶基因，而不具备剪切DNA的功能。因此，将dCas9结合到基因的转录起始位点，可以阻断转录的开始，从而抑制基因表达；将dCas9结合到基因的启动子区域也可以结合转录抑制/活化物，使下游靶基因转录受到抑制或激活。因此dCas9与Cas9、Cas9 nickase的不同之处在于，dCas9造成的激活或者抑制是可逆的，并不会对基因组DNA造成永久性的改变。
4、多重编辑（Multiplex Editing）
将多个sgRNA质粒转入到细胞中，可同时对多个基因进行编辑，具有基因组功能筛选作用。多重编辑的应用包括：使用双Cas9nickases提高基因敲除的准确率、大范围的基因组缺失及同时编辑不同的基因。通常情况下，一个质粒上可以构建2～7个不同的sgRNA进行多重CRISPR基因编辑。
5、功能基因组筛选
利用CRISPR-Cas9进行基因编辑可以产生大量的基因突变细胞，因此利用这些突变细胞可以确认表型的变化是否是由基因或者遗传因素导致的。基因组筛选的传统方法是shRNA技术，但是shRNA有其局限性：具有很高的脱靶效应以及无法抑制全部基因而形成假阴性的结果。CRISRP-Cas9系统的基因组筛选功能具有高特异性和不可逆性的优势，在基因组筛选中得到了广泛的应用。目前CRISPR的基因组筛选功能应用于筛选对表型有调节作用的相关基因，如对化疗药物或者毒素产生抑制的基因、影响肿瘤迁移的基因以及构建病毒筛选文库对潜在基因进行大范围筛选等。 CRISPR-Cas9基因编辑技术简介 - 知乎 (zhihu.com)
3. 谁发明了基因编辑工具CRISPR-Cas9
1987年，日本微生物学家石野良纯课题组在克隆大肠杆菌碱性磷酸酶同工酶基因编码序列时，意外发现编码序列附近存在间隔串联重复（5个）的DNA片段，每个重复片段含29个保守碱基且具有内部碱基互补的回文结构，这些保守片段之间由32个碱基的居间序列隔开。 2015年生命科学突破奖授予6位科学家（每位获奖者300万美元），其中两位女性为加州大学伯克利分校的美国生物化学家杜德娜和德国汉诺威医学院/赫尔姆霍茨感染研究中心的法国生物化学家卡彭蒂耶，以表彰她们在“具有潜在**性DNA编辑工具——CRISPR-Cas9技术发明中的重要贡献”。
4. CRISPR-Cas9基因编辑2--gRNA设计（下）
我对之前的所有教程进行了再次详细的总结 CRISPR-Cas9基因编辑之背景介绍及gRNA设计（上）
在上一次文章中，我们已经得到了在线工具设计的sgRNA序列，经由简单评估后选择出合适的sgRNA
以上一次文章查到的PTEN knockout cell line 为案例，根据给出的PTEN sgRNA，完善oligo序列，并再Snapgene软件中匹配出来
使用Snapgene一键生成oligo，Actions--Anneal Oligos
粘贴事先准备好的序列--保存Oligo文件
（1）打开一个pSpCas9质粒--actin--restriction cloning--insert fragment
（2）在Vector选项卡，选择内切酶为BbsI，在insert部分选择上一步中保存好的oligo，最后点击clone，保存DNA文件。
（3）打开插入后的质粒图谱，检查oligo插入情况，无误后可提交上表中的PTEN-Oligo.Top/Bottom至公司合成。
这里检测所用的引物和平时做PCR检测mRNA表达的引物是不同的，这里的PCR产物必须覆盖基因编辑的位置，且产物要足够长，至少500 bp。在这里我们以P53为例子：
（1）找到包括sgRNA序列的前后1000个碱基的序列（2000 bp）
（2）将找到的序列复制粘贴到blast中 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/
设置参数
（3）得到结果（小测试，为何得到的引物只有两对，而且似乎有一对还偏离中心很远，请问应该如何设置，使得产物聚集在中心？）
（4）查看引物基本情况，检查无误可提交公司合成
结语： 以上，我们则是完成了sgRNA及引物设计，提交公司合成，拿到之后则可开始正式实验了，感兴趣的同学，可以完成上面的小测试，有问题请在下方留言，拜拜~
5. 2021-07-04 CRISPR-Cas9 基因编辑原理详解
CRISPR-Cas 系统（The clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats-associated protein systems）是一个细菌及古细菌进化出来用以抵御病毒和质粒入侵的适应性机制。CRISPR-Cas 系统的高效基因组编辑功能已被应用于多种生物，包括斑马鱼、小鼠、大鼠、秀丽隐杆线虫、植物及细菌。多个科研小组的研究都显示，与锌指核酸酶（ZFNs）和转录激活样效应核酸酶（Transcription activator-like effector nucleases, TALEN）相比较，CRISPR-Cas 系统介导的基因组靶向实验在细胞或斑马鱼中具有相似甚至更高的效率。
CRISPR-Cas9 体系的 RNA-DNA 识别机制为基因组工程研究提供了一项简便而强大的工具。该体系其中一个最重要的优势是 Cas9 蛋白可在多个不同的 gRNA 的引导下同时靶向多个基因组位点。
图 1. CRISPR/Cas9 介导的基因组编辑原理图
在 II 型 CRISPR 系统中，CRISPR RNA（crRNA）与转录激活 crRNA（Trans-activating crRNA, tracrRNA）退火形成的复合物能特异识别基因组序列，引导 Cas9 核酸内切酶在目的片段生成 DNA 双链断裂（double-strand breaks, DSBs）。 这个识别复合体可以通过融合 crRNA 与 tracrRNA 序列形成 sgRNA（single-guided RNA）进行简化。基因组的靶序列中有长约 20bp 的片段与 crRNA 或 sgRNA 互补配对；靶序列末端的三核苷酸区域 PAM（5『-NGG-3』）为 Cas9 识别位点，是实现剪切功能的关键。
图 2. CRISPR-Cas9 介导的基因编辑。（左）：sgRNA 引导 Cas9 核酸酶作用于基因组，形成的 DSBs 被非同源末端连接（NHEJ）机制修复；（右）：sgRNA 引导 Cas9 核酸酶作用于基因组，形成 DSBs，同源重组（HR）作用下，供体质粒上的目标基因及筛选标记（或其他遗传元件）在断裂处被整合进基因组。
图 3: 切口酶在结合链生产单链切口的原理图
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| 用途 | 产品 | | 基因敲除 | sgRNA文库 | | Cas9核酸酶 /慢病毒 /切口酶表达克隆 | | GeneHero™ Cas9蛋白 | | GeneHero™ Cas9 稳定表达细胞株 | | 基因敲入 | HDR 供体克隆载体 | | Safe Harbor 基因敲入试剂盒 | | 预制稳转株 | GeneHero™ CRISPRi 预制稳转株 | | GeneHero™ CRISPRa预制稳转株 | | 功能验证 | IndelCheck™ CRISPR/TALEN 插入缺失检测体系 |
6. CRISPR-Cas9基因编辑5--不可或缺的sgRNA活性预实验
大家都知道CRISPR-Cas9有脱靶效应，并且每个sgRNA的效率都不一样的，因此在做正式实验之前，我们要验证sgRNA的效率，之后优中选优。还是那句话，同样的目的有很多不同的方案，我了解到的有：
欢迎大家补充，互相交流，提供更方便快捷的方案，由于我们实验室购买试剂盒时间长，相对困难，且sgRNA的切割效率的验证还是活细胞内效率最为准确。经过课题组师兄DZ的优化，一般我们针对一个基因的简单敲除，设计2个sgRNA即可，并且选择方案2进行验证。
接前期推文，我们做了一手漂亮的质粒转染后， 如何确定sgRNA切割活性，这条sgRNA到底还要不要，就看今天了 。
（1）293细胞转染
在转染前一天，将293细胞以单细胞分散状态种至6孔板中，组别设计为： 293未转染组（negative control），293转染组 。转染当天293细胞融合度为30 40%，将2.0 2.5 μg pSpCas9_sgRNA质粒使用lipofectamine 3000按照常规条件转染（具体细节请参照上期文章），72 h内进行下一步实验。
注意事项：由于293细胞贴壁不牢，很容易被吹落，因此在滴加转染试剂的时候要十分轻柔，换液时要更加小心沿壁加入，并且培养基要提前预温。
（2）提取293细胞基因组DNA
这里我们使用的是天根公司的基因组DNA提取试剂盒，严格按照试剂盒要求即可。
（3）使用高保真DNA聚合酶完成PCR实验
一定要使用高保真酶的原因是，T7 EI内切酶的原理是识别突变位点，所以如果使用的DNA聚合酶不够保真，在PCR过程扩增错误，引入突变，则会影响后续结果。 在这里需要提醒的是，任何DNA聚合酶的使用，一定要严格查阅相应说明书，确定实验条件 。我们使用的是NEB公司的Q5高保真DNA聚合酶，根据说明书指示，Q5 DNA聚合酶做的PCR实验，其primer的退火温度和普通我们使用的不一样，需要使用NEB公司的Tm calculator工具计算得出。
（4）胶回收PCR扩增出的目的序列 胶回收的原则就是，量大质优，严格按照说明书操作即可。
（5）T7 Endonuclease I 酶切实验 配置实验反应
按照以下条件annealing
设置酶切反应后，37 ℃孵育15分钟
（6）琼脂糖凝胶电泳，预测分子量大小<1 kb，使用 1.5 2%琼脂糖；分子量大小为1 10 kb大小时，选用1-1.2%
（7）结果分析示例
CRISPR-Cas9基因编辑的直接敲除系列，今天写到这里算是完成了预实验部分。这个时候可以把整个方案的流程放在这里权当总结，并提示之后实验方向方向：
准备工作和预实验要至少得到以下简化的实验结果：
7. CRISPR-Cas9基因编辑7--测序验证敲除
使用挑单克隆技术得到多个单克隆细胞系后，就要开始验证敲除，除了蛋白表达水平的检测，最终还是要看测序结果。关于测序的方案也是各有不同，由于之前选用的是CRISPR-Cas9 NHEJ介导的编辑方法，因此测以sgRNA为中心点，长度约为500 bp的目的序列即可查看基因编辑后的基因型。而对于依赖模板的HDR介导的CRISPR-Cas9编辑方法，则检测方法要更加复杂一些。在这里，需要提一句的是，基因编辑不仅仅是切就完事了，Cas9造成DNA双链断裂（DNA double breaks, DSBs） 之后，有多种DNA修复方式，而细胞修复能力的强弱，也决定着基因编辑的效率。这或许是为什么不同的细胞的编辑效率有差的另一个原因。
常规试剂： 基因组DNA提取试剂盒， Taq DNA Polymerase （以下简称Taq，如果有条件可以配备 Platinum™ Taq DNA Polymerase High Fidelity ）， Q5® High-Fidelity DNA Polymerase （以下简称Q5） ，胶回收试剂盒， TA Cloning™ Kit, with pCR™2.1 Vector （以下简称T4载体） ，感受态细胞.
将单克隆细胞种到6孔板中，约80%融合度后提取基因组DNA。以基因组DNA为模板，用Taq PCR实验P出目的基因条带。
因为Taq DNA聚合酶P出来的条带带有A尾，可连接T4载体，因此，任何可以使得P出来的产物带A尾的DNA聚合酶都可以使用。倘若课题组有平端的测序用载体，则可以使用Q5高保真DNA聚合酶。这里PCR产物需要考虑能否和后续测序载体匹配。总结如下：
（1）基因组DNA提取后PCR
由于课题组条件限制，我们只有T4测序载体，这个载体要求PCR产物是有A尾的。但是我们课题组并没有高保真的Taq DNA聚合酶，因此我使用Q5高保真DNA聚合酶完成PCR扩增实验，选择50 µl体系，不加GC Enhancer。
（2）纯化PCR产物
将PCR扩增产物，跑上琼脂糖凝胶电泳，而后使用胶回收试剂盒回收PCR产物。这步骤按照试剂盒说明书即可，注意凝胶电泳的条带要亮亮亮亮亮亮的，回收回来的量才够用。这部分按照产品说明书操作即可。
将PCR产物，配合目的基因单边引物，送样测序。
（2.1）加A尾，从而使得PCR产物可以与T载体相连接
Set up the reaction system
72 ℃ incubation 20-40 mins (we use 40 min at this time)
（3）PCR产物连接T载体后转化感受态细胞
以Theromo公司T4载体为例
Set up reactions
incubation at RT for 5 minutes
（4）划平板挑克隆扩增
（5）送样测序
先送PCR产物测序，根据PCR产物测序结果再考虑是否送T载体测序。如PCR产物测序结果显示为有基因变化、套峰等，则可送单克隆菌落测序。
（6）使用Snapgene软件查看测序结果
打开目的基因序列文件，按下图操作。
载入需要比对的序列文件，查看序列是否为野生型，是否为双峰。
对于以NHEJ介导的基因编辑方法，其主要靠碱基缺失或插入不为3的碱基数，造成后续阅读框移码突变，从而可能造成蛋白系列或空间构象改变，蛋白失去原有的功能，因此达到敲除的目的。
（1）序列如为野生型则说明基因编辑失败；
（2）测序序列如为双峰（套峰）则说明是杂合子，可手动拆开查看基因序列，同时还需将单克隆菌液送测序以得到完成的测序结果；
（3）如为纯合子则说明等位敲除了同样的碱基。碱基变化数目为3的倍数时，因无法造成移码突变，敲除可能会失败。需要碱基变化数目不为3的倍数，才可算成功，如上图所示，有一条链缺失了一个C碱基，因此造成后面阅读框的移码突变，蛋白失效则达到敲除的目的。
8. crispr-cas怎么导致基因改变
4月15日，隶属于麻省理工学院和哈佛大学的世界著名生物医学研究机构Broad研究所宣布，美国专利局批准了由他们所申请的基于CRISPR-Cas9系统的基因编辑技术专利。这是目前世界第一例获得专利保护的基于CRISPR-Cas9系统的基因编辑技术。 正在生物体内发挥功能的CRISPR-Cas9系统。插画家：Stephen Dixon 所谓基因编辑技术，是指对DNA核苷酸序列进行删除和插入等操作，换句话说，基因编辑技术使得人们可以依靠自己的意愿改写DNA这本由脱氧核苷酸写而成的生命之书。然而长期以来，对DNA的编辑只能通过物理和化学诱变、同源重组等方式来对DNA进行编辑。然而这些方法要么编辑位置随机，要么需要花费大量人力物力进行操作。因此，能够方便而精确的对DNA和核苷酸序列进行编辑，是科研工作者们长期以来的梦想。CRISPR-Cas9系统的诞生和成熟标志这这一梦想逐渐变为现实。此外不仅仅在科研界，在诸如医疗、农业、畜牧业等研究中，这一技术也显现除了巨大的应用前景。因此，这一技术获得专利，是该技术走向应用的里程碑式事件。 从细菌免疫系统到DNA编辑工具 CRISPR-Cas9系统并非天生就是为人类使用而产生的。它的本质其实是细菌中一种对付诸如病毒等外来DNA的防御系统。在一些细菌基因组中存在一系列成簇排列的DNA序列，被称作“规律间隔成簇短回文重复序列”（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR）。这些重复序列的间隔序列，被发现和很多能够侵入细菌的噬菌体DNA序列相同。进一步研究发现，这些序列在被转录成为RNA后，能够和细菌产生的一类称为Cas的蛋白质形成复合体，来对Cas蛋白起到导向作用，因此这段RNA也被称为导向RNA（guide RNA，gRNA）。当复合体检测到入侵的DNA和gRNA序列一致时，Cas蛋白就能够切割入侵的DNA，达到防御的目的。 注：严格来说，在细菌体内gRNA由两部分组成：一部分为活化Cas蛋白所需的tracrRNA，另一部分为来自于间隔区、识别入侵DNA的crRNA。在人工构建的CRISPR-Cas9系统载体中，这两段RNA可融合为一条。 CRISPR-Cas系统这种序列特异性的DNA切割机制很快引起了人们的兴趣。由于这一系统能够切割DNA，并且其序列特异性由crRNA的序列所决定，因此它成为了DNA编辑的理想工具。细菌中的CRISPR-Cas系统极为多样，而一个来自产脓链球菌（Streptococcus pyogenes）的由Cas9蛋白参与的系统被人们研究的最为透彻。因此人们对它进行了改造，将编码Cas9蛋白的序列及其附属元件共同制造成为一个单一的载体。同时为了能够让这些组分进入真核细胞的细胞核，还加入了入核信号元件。这样一来，只要科研人员只需针对需要编辑的DNA序列合成一段DNA序列，插入这个载体的特定部位。在转入宿主细胞后，产生的人工构建的gRNA就能指导Cas9蛋白切割宿主细胞特定的DNA序列，从而起到基因编辑的作用。 CRISPR-Cas9基因编辑系统示意。图片来源：《生物化学与生物物理进展》 DNA编辑的广泛前景 CRISPR-Cas9系统，被称为第三代基因编辑技术。相比于它的两位前辈ZFN系统和TALEN系统，它有着一些无可比拟的优点。首先，CRISPR-Cas9系统的可用位置更多。理论上基因组中每8个碱基就能找到一个可以用CRISPR-Cas9进行编辑的位置，可以说这一技术能对任一基因进行操作，而TALEN和ZFN系统则在数百甚至上千个碱基中才能找到一个可用位点，这大大限制了使用范围。其次，CRISPR-Cas9系统更具有可拓展性，例如可以通过对Cas9蛋白的修饰，让它不切断DNA双链，而只是切开单链，这样可以大大降低切开双链后带来的非同源末端连接造成的染色体变异风险。此外还可以将Cas9蛋白连接其他功能蛋白，来在特定DNA序列上研究这些蛋白对细胞的影响。第三，更为重要的是，CRISPR-Cas9系统的使用极为方便，只需要简单的几步就能完成，几乎任何实验室都可以开展工作，而不需要向ZFN和TALEN那样借助商业公司的协助完成。由于以上特点，CRISPR-Cas9被评为2013年生物学10大突破之一。值得说明的是，CRISPR-Cas9系统在真核细胞中很多重要的研究，都是由华人学者张峰主持完成的。 由于来源于细菌的CRISPR-Cas9系统在真核细胞内也能很好的工作，这显示出了其巨大的应用潜力。例如在基础科学研究领域，CRISPR-Cas9系统最多的是被用来定点敲除一些基因，从而便于研究这些基因的生物学功能。同时CRISPR-Cas9系统的商业化应用潜力也不容小视。例如在生物治疗领域，结合诱导多能干细胞（iPS）技术，人们可以将通过基因编辑修复的iPS细胞重新发育为正常组织和器官来供病人使用。而在家畜育种等工作中，对一些关键性状基因的编辑能够大大加快良种的育种速度。 正是由于CRISPR-Cas9的诸多优秀特点和广泛的应用前景，因此它成为了专利申请的热门方面。尽管已经有多份应用CRISPR序列或Cas蛋白的技术专利，但这次Broad研究所获得批准的是第一份将一整套CRISPR-Cas9系统载体和操作方法包括在内的专利。这意味着今后使用这一技术进行基因编辑操作都将涉及这份专利所保护的内容。那么，专利的批准是否会妨碍这一技术的使用呢？目前来看，基础研究受到影响的可能性不大，因为Broad研究院的主任埃里克·兰德（Eric Lander）在专利宣布的新闻稿中表示：“考虑到Broad研究所的使命是为了加速我们对于疾病的理解和治疗，因此我们承诺授权给全球的研究团队使用这种技术的权利。”但是，在更有利可图的商业化应用领域，这一专利的出现是否会对使用该技术的企业造成影响还有待观察，毕竟Broad研究所在上述表态之外还有一句：“享有这一专利的限制权”
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